F-box 蛋白是最大的調節蛋白家族之一，在蛋白質降解中起重要作用。在植物中，F 蛋白在功能上非常多樣化，只有一小部分被詳細表征。本文鑒定了一種新型 F-box 蛋白 FBX92 作為擬南芥葉片生長的抑制劑。AtFBX92 的過度表達導致植物的葉子比野生型小，而AtFBX92水平降低的植物則通過刺激細胞增殖而增加葉片生長。詳細的細胞分析表明，AtFBX92 特別影響早期葉片發育過程中的細胞分裂速率。AtFBX92水平降低的植物中幾個細胞周期基因表達水平的增加支持了這一點。而玉米同源基因ZmFBX92 在玉米中的過表達對植物生長沒有影響，而擬南芥中的異位表達增加了葉子的生長。截斷形式的 AtFBX92 的表達表明，ZmFBX92和AtFBX92在擬南芥中功能增益的對比效應是由于ZmFBX92基因中缺少F-box相關結構域。我們的工作揭示了復雜網絡中的另一個參與者，它決定了葉子的大小并為識別假定的底物奠定了基礎。
ZmFBX92OE和WT植物的表型分析顯示，轉基因植物的葉面積顯著較大，其他表型正常（圖1）。在標準和輕度滲透脅迫條件下體外生長的WT和ZmFBX92OE植株的預計花環面積（PRA）在分層后6天至21天（DAS）確定（圖1A）。平均而言，脅迫在21 DAS 時使花環面積減少了約 60%。在兩種條件下，ZmFBX92OE 植物與WT相比具有顯著增加的花環面積（圖1A）。ZmFBX92OE 對擬南芥葉片大小的積極影響通過確定22 DAS時的單個葉面積得到證實（圖1B、C）。ZmFBX92OE 植物的成熟葉和幼葉都較大。為了檢查細胞增殖和/或細胞擴增的差異在多大程度上導致葉片尺寸增加，在WT和ZmFBX92OE葉片中比較了背面表皮細胞的數量和尺寸。ZmFBX92OE 植物中*成熟（22DAS）的第三片葉子由于細胞數量的高度增加（約70%）而增大了約30%，這部分被細胞大小減少約20%（圖1D）所補償。因此，ZmFBX92 在擬南芥中的異位表達導致葉片變大，主要是由于細胞數量增加。
與異位表達ZmFBX92的植物所觀察到的相反，與WT植物相比，AtFBX92OE 植物的花環面積減少（圖 2A）。這種減少在輕度滲透脅迫下相當。在AtFBX92OE植物中沒有觀察到其他明顯的表型。從6個DAS開始，在發育的早期就已經可以看到減小的花環大小（圖 2A）。AtFBX92過表達對葉生長的負面影響通過測定體外生長的 22 天齡植物的單個葉面積得到證實。與WT相比，AtFBX92OE7植物的成熟葉面積顯著較小，而對于AtFBX92OE2 植物，所有葉子都顯著較小，包括幼葉（圖2B、C）。為了探索葉片尺寸減小的細胞基礎，在細胞水平上分析了體外生長的 AtFBX92OE 和WT植物的葉片發育。與ZmFBX92OE的情況類似，第三片葉子背面表皮的細胞數量和細胞大小在21 DAS時確定，此時這片葉子*成熟（圖2D）。AtFBX92OE2和AtFBX92OE7的成熟第三葉分別比WT小45%和16%，這是由于細胞數量大幅減少，部分補償通過增加的單元尺寸。
圖1.（左圖）ZmFBX92表達對擬南芥花環和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細胞基礎
圖2.（右圖）在標準體外條件下AtFBX92異位表達對花環和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細胞基礎
圖3.（左圖）體外標準條件下AtFBX92 下調對花環和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細胞基礎
圖4.（右圖）體外標準條件下AtFBX92del 表達對花環和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細胞基礎
與過度表達AtFBX92的植物平行，通過使用以下工具設計靶向AtFBX92的人microRNA（amiRNA），產生表達水平降低的轉基因植物。對三個表達水平降低的純合、獨立、單基因座系的葉片表型進行了分析，由于它們非常相似，因此僅給出了amiFBX92-4（以下稱為amiFBX92）的結果（圖3。從DAS的第5天到第21天測定PRA，并顯示amiFBX92中的PRA比分析第一天起的WT更大（圖3A）。在輕度滲透脅迫下，PRA的增加具有可比性。接下來，在21 DAS測定單個葉面積。除amiFBX92的葉片3外，所有葉片均顯著大于WT的葉片（圖3B，C）。21 DAS時*成熟的第一對葉的細胞分析表明，葉面積的（24%）是由于細胞數量增加（47%），部分由細胞大小減?。?6%）補償（圖3D）。綜上所述，我們的數據表明改變AtFBX92表達水平以相反的方式影響葉片大小，這主要是細胞數量差異的結果。
PRA 隨時間的定量圖像分析，從 6 DAS 到 24 DAS，表明 AtFBX92del 植物比 WT 大（圖 4A）。 此外，PRA 增加在發育過程中很早就開始（圖 4A），類似于ZmFBX92OE 和 amiFBX92 品系中觀察到的效果。與此一致，在 20 DAS 確定的單個葉面積顯著大于 WT（圖 4B、C）。 一致地，在 20 DAS 時第一對葉的大小增加（27%）是由于細胞數量增加（29%），而對細胞大小沒有顯著影響（圖 4D）。
圖5.在標準和干旱脅迫條件下，AtFBX92錯誤表達對土壤中生長的植物葉片大小的影響
為了驗證在體外觀察到的AtFBX92表達水平改變的植物花環大小的差異，在自動成像平臺 WIWAM 上的土壤中種植了AtFBX92OE、amiFBX92、AtFBX92del和相應的WT植物。分析了每個構建體的兩條線。本文也可以證實，在土壤中AtFBX92OE植物比WT小，而amiFBX92和AtFBX92del植物更大，盡管對于AtFBX92del植物這只能在兩條線之一中得到證實（圖 5A）一般來說，土壤中的影響似乎不如體外顯著，因為與WT的絕對百分比差異在體外總是大于在土壤中。通過向培養基中添加甘露醇，在滲透脅迫條件下生長的 AtFBX92OE和amiFBX92植物PRA減少與在這些條件下生長的WT植物的PRA減少沒有顯著差異。向生長培養基中添加甘露醇通常在實驗室環境中用作滲透脅迫的代表。由于土壤種植植物的反應更接近自然條件，還評估了輕度干旱脅迫對AtFBX92水平改變的土壤種植植物和WT植物的影響（圖 5B）。
